Larry Daley (Ben Stiller) é um homem que está prestes a perder a guarda de seu filho (caso não consiga pagar o seu aluguel), e aceita trabalhar no turno da madrugada no Museu de História Natural de Nova York. Logo em seu primeiro turno, coisas estranhas começam a acontecer: esqueletos de dinossauros e estátuas de cera começam a ganhar vida, gladiadores romanos e cowboys saem de suas maquetes e travam batalhas épicas; em sua busca por fogo, um neandertal queima sua vitrine; átila – O Huno começa a pilhar a sua ala do museu e um Tiranossauro lembra a todos os motivos pelos quais ele é considerado o maior predador de todos os tempos. Aos poucos ele vai descobrindo (graças ao manual fornecido pelas outros guardas que são seus companheiros) detalhes do museu e, em meio ao caos, a única pessoa que acaba ajudando o segurança é a figura de cera do presidente Teddy Roosevelt. Descobrimos durante o filme que todos se tornam vivos de noite desde a chegada de uma placa ao museu. Em um noite onde Larry resolve levar se filho ao museu, ele acaba descobrindo que os outros vigias estão tentando roubar a placa (que também passa energia aos seres humanos) para se tornarerm imortais.
Depois de muita confusão (todos os animais acabam saindo do museu a noite), Larry recupera a placa e salva o museu, se tornando o chefe da vigilância a noite devido a todos na cidade acharem que a confusão criada pelos animais a noite ser na verdade uma jogada de marketing.
