Ben Stiller volta nesta sequência no papel de Larry Daley, cargo de guarda-noturno no Museu de História Natural, em Nova York. Mas desta vez a ação se dá no museu Smithsonian de Washington, na capital dos Estados Unidos, onde ganham vida personalidades da história americana – entre eles presidentes, Amelia Earhart (Amy Adams), uma das pioneiras da aviação; além de um improvável faraó, Kah Mun Rah (Hank Azaria). O desenrolar do filme acontece praticamente todo no museu Smithsonian em Washington D.C, onde Larry enfrenta mais um desafio como guarda noturno. Ele precisa recuperar a tábua que da vida aos objetos do museu e salvar seus amigos que foram transferidos do museu antigo e agora estão presos nas mãos do lider faraó. Após muita perseguição e batalhas, Jedediah é capturado e preso numa ampola de tempo (aquelas que conta o tempo através do cair da areia), pelo faraó que da um prazo de uma hora para Larry descobrir o segredo que ativa a magia da tábua. Com a ajuda das miniaturas de Einstein ele e Amelia conseguem a sequencia do código que ativa o poder da tábua, o número PI. Mesmo obrigado a entregar o código ao Kah Mun Rah, ele se recusa, porém os capangas que se aliaram ao Kah Mun Rah, fizeram o Einstein em miniatura falar pra eles também depois de captura-lo. O faraó finalmente ativa a tábua e através de um portal que se abriu pela magia da mesma, seu exército entra no museu. Quando tudo parecia perdido, entra em ação o pequeno soldado montado em um esquilo que trás com ele nada mais nada menos que a estátua gigante de Abraham Lincoln, abraham acaba com os soldados do Kah Mun Rah que correm de medo de volta para o portal! Inicia-se um nova batalha agora entre os campangas do Kah Mun Rah e os amigos do Larry.
Os amigos acabam vencendo e após Larry batalhar mano a mano contra o Kah Mun Rah, ele com a lanterna e o Kah Mun Rah com uma foice, ele acaba ganhando e empurra o Kah Mun Rah de volta para o portal onde ele some de vez. Com a ajuda da aviadora Amelia, ele leva seus amigos de volta ao antigo museu, agora reformado. Todos os objetos/monumentos/
